همکاری نوروژنیک 3 با فوکسا 2 برای فعال سازی اتوماتیک خصوصیات ژنتیکی Neurogenin3 cooperates with Foxa2 to autoactivate its own expression

مقدمه

فاکتور رونویسی نوروژنیک 3 به عنوان تنظیم کننده اصلی ساخت غدد درون ریز پانکراس، و کمبود آن منجر به گسترش بیماری دیابت در انسان و موش شده است. در پانکراس نارس، نوروژنیک 3 به صورت ناپایدار در سطوح بالا از نظر حیطه زمان محدود برای آغاز جداسازی غدد درون ریز در سلول های بنیادی پراکنده، مد نظر قرار می گیرد. مکانیسم هایی که به کنترل این تغییرات سریع و قدرتمند در ویژگی های ژنتیکی نوروژنیک 3 می پرداژند ناشناخته هستند. در این بررسی، ما چرخه تنظیم خودکار اصلی نوروژنیک 3 را مد نظر قرار می دهیم به صورتی که این فاکتور به سرعت سطوح خودش را تحت تاثیر قرار می دهد. ما نشان می دهیم که نوروژنیک 3 در پیوند با بخش های بالادست پایدار ژن های خود، همانند حذف نشانه های رنگینه فعال و فعالسازی رونویسی توروژن  3 می باشد. علاوه بر این، نشان می دهیم که فاکتورهای چنگال سری اندودرمی فوکسال 1 و فوکسال 2 می تواند همکاری هماهنگی برای افزایش تنظیم خودکار نوروژنیک 3 در محیط آزمایشگاهی داشته باشد. به هر حال، تنها فوکسا 2 در همکاری با نوروژنیک 3 در فرآوری مربوط به پانکراس بوده، و به این ترتیب نقش اصلی را برای این فاکتور در تنظیم خصوصیات ژنتیکی بافت ژنده را نشان می دهد. همچنین علاوه بر کاهش تنظیم خودکار نوروژن 3، بازداری فوکسا 2 توسط مداخله RNA، باعث کاهش فعالیت مستقل نوروژنیک 3 برنامه توسعه غدد درون ریز در کانال های پیوندی سلول های mPAC می گردد. از این رو، این داده ها همکاری بلقوه عملکردی را بین دودمان غدد درون ریز را کشف می کنند- و به تعیین فاکتور نوروژنیک 3 و فاکتور بنیادی اندودرم گسترده فوکسا 2 در پیوند برنامه توسعه غدد درون ریز پانکراس می پرداژند.

پانکراس متشکل از بافت غدد مترشحه ( سلول های مجرا و آسینال) و سلول های درون ریز ( انسولین  و گلوکاگون ، سوماتواستاتین ، پلی پپتید پانکراس (PP) و هورمون گرلین  می باشد که در جزایر لانگرهانس سازماندهی می شوند. در طی رشد رویانی، تمایز این انواع سلول های مجزا از طریق فعال سازی و غیرفعال سازی هماهنگ و منظم تنظیم کننده رونویسی کنترل می شوند.

در این بین، فاکتور رونویسی مارپیچ (bHLH) نوروژنیک 3 ( نوروژن 3) به اجرای برنامه جداسازی غدد درون ریز سلول های بنیادی پانکراس چندتوانی (MPCs) می پردازد. موش هایی که فاقد نوروژن 3 می باشد از همان بدو تولد بدون هیچ سلول غدد درون ریز پانکراس متولد می شوند [1]، و بررسی  متوالی دودمان ژنتیکی اثبات می کند که تمام سلول های غدد درون ریز جزایر لانگرهانس حاصل سلول های بنیادی اصلی نوروژن 3 می باشند [2]. این یافته که نقص در نوروژن 3 از طریق جهش در ژن های نوروژن 3 که در دیابت نوزادان ایجاد می گردد، اهمیت فاکتور رونویسی را در رشد و فعالیت سلول جزایر لانگرهانس انسان، نشان می دهد [3-5]. علاوه بر این، نوروژن 3 برای جداسازی غدد درون ریز در چندین بافت سلولی ژنده و آزمایشگاهی [6-9] مناسب می باشد، که پتانسیل های آن را به عنوان ابزاری برای جایگزینی سلول های  از انواع سلول های دیگر برای درمان دیابت مد نظرر قرار می دهد.

نوروژن 3، به طور موقتی در سلول های بنیادی پانکراس چندتوانی (MPCs) پراکنده در بخش خرطومی پانکراس در حال رشد، نشان داده می شود، تنظیمات نوروژن 3 بطور پیشرونده ای زمانی که رونوشت غدد درون ریز آغاز می گردد، بهم خورده و در سطوح پایین بعضی از سلول های جزایر لانگرهانس بالغ [6,10] باقی می ماند. با وجود ارتباط آن با شکل گیری سلول غدد درون ریز، مکانیسم های ملکولی که به کنترل خصوصیات ژنتیکی نوروژن 3 می پرداژند، ناشناخته می باشند. تایید شده است که، فاکتورهای رونویسی HNF6/Onecut1، HNF1b/Tcf2 ، HNF3b/Foxa2، Sox9، Pdx1، و Glis3 همگی به عنوان تنظیم کننده های بالادست ژن نوروژن 3 می باشند [11- 15]. بلعکس، به موازات رشد عصبی، مسیر سیگنالینگ شکاف، به صورت منفی به تنظیم خصوصیات ژنتیکی نوروژن 3 از طریق عوامل بازدارنده رونویسی می گردند Hes1 [16]، که نشان می دهد آزادسازی از عوامل بازدارنده میانجی Hes-1 برای فعال سازی ژن نوروژن 3 در MPCs مورد نیاز می باشد. در انطباق با این مفهوم، فقدان Hes1 در رشد اندودرم پیش شکم برای تحریک شکل گیری سلول های غدد درون ریز غیر طبیعی کافی می باشد [17].

بررسی های اخیر اشاره می کند که رسیدن به سطوح بالای نوروژن3 برای تعهد سلول های غدد درون ریز مهم می باشد. بنابراین، نوروژن 3 پایین که نمایانگر MPCs می باشد مطابق با سرنوشت غدد مترشحه دیگر بوده [18,19] و نارسایی نوروژن 3 منجر به کاهش توده سلولی غدد درون ریز می گردد [18]. از این رو، مکانیسم های فعال سازی می بایست به گونه ای فعالیت کنند که امکان افزایش قابل توجه و سریع در خصوصیات ژنتیکی نوروژن 3 را در حیطه زمانی محدود که بنا به تخمین <24h می باشد، ایجاد می کند [20,19]. یکی از مکانیسم های مطرح شده ای که نوروژن 3 منجر به افزایش سطوح پروتئین می گردد از طریق چرخه بازخوردی اصلی می باشد که شامل اهداف Myt1b نوروژن 3 می باشد، که باعث فعالسازی رونویسی ژن های نوروژن 3 می گردد [21]. مکانیسم مورد استفاده دیگر برای فاکتورهای رونویسی برای کنترل سطوح پروتئین، خود- تنظیمی می باشد.  در این مورد، نوروژن 3 برونزاد باعث تحریک ژن نوروژن 3 درونی موش ها در سلول های mPAC مجرا مانند پانکراس می گردد [8]. بنابراین منجر به خود تنظیمی اصلی به عنوان مکانیسم بلقوه ای می گردد که سهمی در انباشت سریع پروتئین نوروژن 3 در سلول های بنیادی غدد درون ریز دارد. بنابراین، در تناقض آشکار با نتایج مربوط به سلول های mPAC ، نشان داده شده است که نوروژن 3 به عنوان مانعی برای تقویت کننده های خود در فیبروبلاست NIH3T3 می گردد [16]. با توجه به ماهیت ناپایدار خصوصیات ژنتیکی نوروژن 3 در سلول های بنیادی غدد درون ریز، این مسئله قابل درک می باشد که مکانیسم های تنظیم کننده منفی و اصلی به صورت هماهنگ مقررات سفت و سختی از خصوصیات ژنتیکی نوروژن 3 را در طی رشد پانکراس ایجاد می کنند.

به دلیل نقش مهمی که توسط نوروژن 3 در شناسایی سرنوشت سلول های غدد درون ریز پانکراس ایفا می شود، رمزگشایی مکانیسم های ملکولی که به تنظیم خصصیات ژنتیکی می پرداژند مهم می باشد تا به طور کامل به این درک برسیم که چگونه تمایز سلولی غدد درون ریز پانکراس انجام می گیرد. بر مبنای مطالعات منتشر شده قبلی که نشان می دهد نوروژن 3 قادر به فعال سازی خصوصیات ژنتیکی خود می باشد [8]، در اینجا درک بیشتری را در زمینه مکانیسم هایی که تنظیم خودکار نوروژن 3 را کنترل می کنند، بدست می آوریم. با استفاده از آزمون ChIP و رخشاگر، نشان می دهیم که فعالیت های نوروژن 3 باعث فعالسازی تقویت کننده های خود از طریق پیوند با بخش های تنظیمی بالادست حفاظت شده می گردد. علاوه بر این، نشان داده ایم که فاکتور رونویسی چنگال سری فوکسا 2 هماهنگ با نوروژن 3 می باشد تا به فعال سازی خودکار ژن نوروژن 3 بپردازد. مهمتر از همه، نشان داده ایم که فوکسا 2 نه تنها برای تنظیم خودکار نوروژن 3 مهم می باشد بلکه برای فعال ساری ژن های هدف نوروژن 3 دیگر ضروری است، که نشان می دهد نوروژن 3 و فوکسا 2 از لحاظ عملیاتی همکاری داشته تا برنامه تمایز غدد درون ریز را در پانکراس ادامه دهند.

روش های آزمایشی

موش ها- موش های CD1 مورد استفاده در این بررسی در بخش های حصاری مانند بر طبق به پروتکل مصوب کمیته حفاظت از حیوانات در دانشگاه بارسلونا نگهداری شدند. صبح روز ظهور پلاگین واژن به عنوان روز رویانی مد نظر قرار می گیرد (E) 0.5.

بردار خصوصیات ژنتیکی و رخشاگر – بخش های 5kb از توالی طرفین از -4864nt به +88nt (+1 محل آغاز رونویسی می باشد) ژن نوروژن 3 موش افزایش داشته که از دی ان ای ژنوم دم موش با استفاده از استر A/B افزایش داشته است.

سپس قطعات 5kb به عنوان الگویی برای ایجاد قطعات تقویت کننده کوتاه تر توسط PCR با استفاده از استر C/B (3kb, -3057nt تا +88nt ) و D/E ( بخش خوشه بندی -3.2kb، -3885nt تا -3217nt) یا با محدودیت های خلاصه شده NheI XhoI (0.9kb, -932nt to +88nt) مورد استفاده قرار می گیرد. توالی اصلی در جدول تکمیلی فهرست می گردند. قطعات 5kb, 3kb و 1kb در بخش های بالادست از ژن های درخشان کرم شب تاب در سایت های KpnI/XhoI برادار pFOXluc کپی می شوند، در حالیکه بخش های افزایشی در بخش فرادست ژن های درخشان کرم شب تاب در سایت KpnI-XhoI از بردار رواجگر pGL3 کپی می گردند. (پرومگا، مادیسون، WI، USA) . برای ایجاد جهش، از کیت جهش زایی مستقیم محل QuikChange II XL استفاده می کنیم و موارد اصلی در جداول تکمیلی فهرست شده اند. ساختار گزارشگر افزونه رخشانگر ساختگی محرک E برای تست اولویت E box نوروژن3/ هترودایمر E47 مورد استفاده قرار می گیرند که توسط کا کرول ( دانشگاه واشنگتون، MO, USA) مطرح شده است. پلاسمید گزارشگر رخشانگر رلینا pRL-CMV بر اساس کنترل ترافراست در تمام تست های رخشانگر مورد استفاده می باشد.

بردارهای خصوصیات ژنتیکی برای نوروژن 3 موش (pCMV-TNT-Neurog3) و موش E47 (pCMV-TNT-E47) قبلا شرح داده شد [13,22]. رمزگشایی بردارهای خصوصیات ژنتیکی فوکسا 1 موش (pCMV-Bgal-Foxa1) و فوکسا 2 موش (pCMV-Bgal-Foxa2) توسط ام ای ناواس مطرح شد. رمز گشایی بردار ژنتیکی موش HNF6 (pCMV4-HNF6) و موش HNF1b (pRSV-HNF1b) توسط ام گانون و جی فرر مطرح شده است.

پرورش سلول و عفونت های ویروسی- تمام خطوط سلولی (mPAC L20, αTC1.6, β TC3 NIH3T3, MIN6, PANC-1)) در گلوکز Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-4.5 g/L رشد داشته اند که با 10% سرم گاوی بعلاوه آنتی بیوتیک ترکیب شده اند. سلول های MIN6 علاوه بر این با گلوتامین 2mM L- و مرکاپتواتانول  ترکیب می گردند.

برای آزمایش های عفونت های ویروسی، سلول ها در صفحات 6 روژنه ای یا صفحات 10 سانتیمتری قرار گرفته و یک روز بعد عمل می آیند ( یا به 70-80% هم آمیزی می رسند) که عفونت های ویروسی دارای 40 تعدد عفونت برای 2-5 ساعت در 37 درجه سانتیگراد در محیط پرورشی می باشند. بنابراین ویروس میانی جایگزین شده و سلول برای دوره 44-48h دیگر پروش می یابد.

تولید و افزایش کدگذاری عوامل ویروسی بازترکیبی نوروژن 3 انسانی و گلاکتوسیداس بتا قبلا مورد بحث قرار گرفت [8]. کدگذاری عوامل ویروسی نسخه ضمیمه HA نوروژن3 موش در آزمون ChIP و ریزش ایمنی توسط جی گرادهول مطرح شد.

ترافراست ناپایدار و آزمون رخشاگر- در مرد آزمون رخشاگر، ، سلول های Mpac یا NIH3T3 در سطح بافت پرورشی یک روز قبل از ترافراست قرار گرفت. ترافراست ناپایدار با استفاده از متافکتین (mPAC) از آزمایشگاه بیونتکس GmbH یا ترانس فاست (NIH3T3) از پرومگا بر طبق به دستورالعمل ساژنده به اجرا گذاشته شد. مقدار DNA مورد استفاده در هر سطح به اندازه 125ng بردار گزارشگر رخشاگر کرم شب تاب، 2.5ng از pRL.CMV و 10ng فاکتور رونویسی Cdna ترافراست بوده است. بردار خصوصیات ژنتیکی در صورت نیاز اضافه شده تا مقدار DNA را در تمام بخش ها حفظ کند. سلول ها 48 ساعت بعد از ترافراست برداشت شده و فعالیت رخشانگر با استفاده از سیستم تست رخشانگر دوگانه با استفاده از لومینومتر ورق خرد ورتیاس تجزیه و تحلیل شد. تفسیر رخشاگر با استفاده از فعالیت های بردار کنترل pRL.CMV به صورت استاندارد در آمد.

برای ترافراست siRNA، سلول های  در سطح 12 شکاف پیوند زده شده و همزمان با 100 pmols از Foxa2 siRNA موش آبگیر SMART یا siControl ترافراست شد و از Metafectene®SI (Biontex) با اسنفاده از دستورالعمل ساژنده استفاده می کرد. روز بعد، سلول ها با عوامل ویروشی بازترکیب همان طور که در بالا شرح داده شد، آلوده شدند.

جداسازی RNA و RT-PCR – RNA کل از خطوط سلولی آغاز شده و پانکراس موش های نارس از کیت RNeasy استفاده می کند. نمونه های RNA توسط DNase به عمل امده تا دی ان ای ژنوم آلوده کننده را حذف کند. اولین رشته Cdna با استفاده از 1- 2μg کل RNA ، آنزیم 3 بالانویس و ماده اولیه هگزامر تصادفی آماده می شود. 1/20 یا 1/40 از cDNA رونویسی شده به عنوان الگویی برای RT-PCR معمول یا PCR زمان واقعی مورد استفاده قرار می گیرد. PCR زمان واقعی بر روی سیستم آشکارسازی توالی ABI Prism 7900 به اجرا در آمده و از واکنشگر SybrGreen استفاده می کند. توالی اصلی PCR در جدول تکمیلی داده می شود.

تست کروماتین IP (ChIP)- سلول های Mpac یا پانکراس E15.5 در 1% فورمالدئید برای 10-15 دقیقه تثبیت شده و اتصال عرضی با افزایش 0.125 mM گلیسین کاهش یافته است. تست Histone ChIPs همان طور که در بخش های دیگر توضیح داده شده، به اجرا گذاشته می شود[22]. تست ChIP در برابر فاکتور رونویسی با استفاده از کیت EpiQuik با دنبال کردن دستورالعمل ساژنده انجام می گیرد. آنتی بادی های مورد استفاده عبارتند از: آنتی دی متیلات و تری دمتیلات H3K4 خرگوش، انتی فوکسا2 بز (HNF3/M20)، آنتی کلون HA-7 موش (سیگما) و خرگوش و موش IgG کنترل شده. دی ان ای مصون توسط PCR زمان واقعی آزمایش می گردد تا سرعت بخش های تقویتی توسط سلول های نیادی فهرست شده در جداول تکمیلی تست گردد. PCR زمان واقعی بر مبنای سیستم آشکارسازی توالی 7900 منشور ABI با استفاده از واکنشگر SybrGreen به اجرا در می آید. درصد توان ورودی به صورت زیر محاسبه می گردد:  .

تحلیل لکه ایمنی و ایمنی رسوب دهی- در ارتباط با آزمایش ایمنی رسوب دهی، سلول های mPAC در بافر coIP کافته می شوند (Tris-HCl 20mM pH 7.5، NaCl 100mM، EDTA 1mM، Igepal CA-630 1%، NaF 5mM،10% ترکیبات بازدارنده پروتئاز از سیگما). حاصل تجزیه سلولی به مدت 15 دقیقه در 4 درجه سانتیگراد نگهداری شده و بقایای سلولی توسط قوه گریز از مرکز در 10,000 x g به مدت 15 دقیقه در 4 درجه سانتیگراد حذف می گردد. سپس محصول تجزیه سلولی با  آنتی فوکسا 2 ( یست فناوری سانتا کروز) یا IgG موش در طول شبانه روز در 4 درجه سانتیگراد ایمنی رسوب دهی می گردد. ترکیب ایمنی با استفاده از مهره های مغناطیسی مزدوج G پروتئین بازیافت شده . از طریق جوشاندن در بافر لامیل SDS زدوده می شود. برای اماده سازی کل عصاره سلولی، سلول های mPAC در بافر فروکافتی شوینده سه گانه کافته شده (Tris-HCl 50mM، NaCl 150mM، 0.1% SDS، 1% NP40، و 0.5% دی اکسی کلات سدیم). حاصل تجزیه سلولی به مدت 20 دقیقه در 4 درجه سانتیگراد نگه داشته شده و بقایای سلولی همان طور که در بالا بحث شد حذف می گردند.

 از کل عصاره سلولی و ایمنی رسوب دهی توسط الکتروفورز PAGE- SDS حذف شده، و به غشای چند پوششی PVDF انتقال می یابند و شبانه در 4 درجه سانتیگراد با قوکسا 2 ضد موش و بز، آنتی –HA موش (1:1000, Sigma) یا بتا اکتین (1:1000, Sigma) نگهداری می شوند. لکه ها توسط واکنشگر ECL قابل مشاهده می باشند که از لومی ایمیجر LAS4000 استفاده می کند. لکه های پروتئین از طریق نرم افزار تصویر j مورد ارزیابی قرار می گیرند.

ایمونوفلورسانس و شیمی سلولی ایمنی- رویان موش در نمک بافر فسفات (PBS) تجزیه شده و مجاری روده ای آن هاف شامل، معده، پانکراس و طحال در 4% پارافورمالدئید به مدت 3 تا 6 ساعت تثبیت می گردد. بعد از سه بار شستشو در PBS ، بافت ها متعاقبا آب زدایی شده و در پارافین جامد قرار داده می شوند و در  برش داده می شوند. در ارتباط با ایمونوفلورسانس، پروتکل تشخیص ایمنی استاندارد رعایت می شود. به طور مختصر، بافت ها آب زدایی شده و در معرض بازیابی آنتی ژن با واسطه حرارت در محلول سیترات در دیگ رودپز به مدت 10 دقیقه قرار می گیرند. بعد از مرحله انسداد در 3% سرم میمون/ 0.2% بافت X-100 تریتون، بخش های بافت در انتی بادی های اولیه زیر قرار می گیرند: آنتی فوکسا 2 بز/ HNF3β 1:100، انتی ساکس خرگوش 1:200، آنتی موسین 1 خرگوش 1:100، انتی نوروژنیک 3 موش 1:500، انتی  -Nkx6.1 1:500انتی Pdx1 1:500 خوک گینه ای، انتی انسولین  1:500 خوک گینه ای، آنتی کروموگرانین خرگوش 1:200. آنتی بادی ثانویه مورد استفاده به نام  Cy2آنتی بز و الاغ، Cy3 ضد موش و الاغ، Cy2 Cy3 ضد خرگوش و الاغ یا الکسا 643، و Cy3 ضد خوک گینه ای و الاغ می باشد.

در ارتباط با شیمی سلولی ایمنی، سلول های mPAC و MIN6 در پوشش شیشه ای قرار گرفته و منجر به انتقال مواد ژنتیکی با گالاکتوزید بتا و عوامل ویروسی نوروژن 3 که در بالا شرح داده شد می گردند. سلول ها 44-48 ساعت بعد از آلودگی در 4% PFA به مدت 20 دقیقه تثبیت شده و در PBS با 0.2-0.5% تریتون X-100 نفوذ می کنند. بعد از مرحله انسداد 1 ساعته با 315 سرم الاغ معمولی، سلول ها به صورت شبانه با انتی بادی در برابر نوروژن 3 موش با رقیق سازی 1:500 قرار داده می شوند. انتی بادی ثانویه مورد استفاده به نام آنتی بادی ضد موش الاغ می باشد. قبل از استقرار در کناره ها، هسته به مدت 3 دقیقه با رقیق سازی 1:500از Hoechst 33258 تغییر رنگ می یابد.

تصاویر فلوروسنت با استفاده از میکروسکوپ میدانی Leica DMI 6000B یا میکروسکوپ هم کانون Leica TCS SPE گرفته می شوند. به منظور تعیین کمیت سطوح نوروژن 3 و فوکسا 2، بررسی هم کانون با استفاده از نرم افزار j مورد تجزیه و تحلیل قرار می گیرد. به طور مختصر، شدت فلوروسانس نوروژن 3 و فوکسا 2 با بیش از 100 سلول اصلی نوروژن 3 مورد ارزیابی قرار گرفته و برای هر کانال برای به حداکثررسانی شدت (100%) برای هر تصویر استانداردسازی می گردد.